實(shí)驗(yàn)室微生物實(shí)驗(yàn)必知的培養(yǎng)制備技術(shù)匯總

　　一、要樹立科學(xué)必須真實(shí)的觀念，實(shí)驗(yàn)態(tài)度要端正。

　　要懷著一顆為了出具真實(shí)、準(zhǔn)確，可信數(shù)據(jù)而敬畏的心去申請(qǐng)能力驗(yàn)證。

　　實(shí)驗(yàn)要求科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn),實(shí)驗(yàn)要預(yù)先充分練習(xí)和實(shí)踐。能力驗(yàn)證是對(duì)實(shí)驗(yàn)室綜合實(shí)驗(yàn)水平（人員，設(shè)備，環(huán)境等多因素）的評(píng)價(jià)。

　　首先要選好實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，找到與之配套的方法，進(jìn)行充分的方法驗(yàn)證，從檢測員能力，儀器設(shè)備性能，校檢結(jié)果是否能滿足實(shí)驗(yàn)需要，實(shí)驗(yàn)檢測多次實(shí)驗(yàn)，檢測環(huán)境是否進(jìn)行了充分的考慮，實(shí)驗(yàn)確認(rèn)好實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，認(rèn)真學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)，理解標(biāo)準(zhǔn)，并做到標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)范的步驟，并對(duì)自己實(shí)驗(yàn)有了一定的信心后再去申請(qǐng)能力驗(yàn)證為宜。

　　舉例：某實(shí)驗(yàn)室未經(jīng)過充分實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)平時(shí)做的也少，直接申請(qǐng)了能力驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)過程生疏，照方抓藥，手忙腳亂，造成稀釋梯度不夠，平板干燥，菌落蔓延，無法出具具體數(shù)值，實(shí)驗(yàn)失敗。

　　二、實(shí)驗(yàn)室收到盲樣菌株標(biāo)本后，首先應(yīng)做的事情利用集菌儀或者微生物檢查儀制備樣品。

　　1、檢查標(biāo)本的性狀和確認(rèn)包裝情況，然后按照要求去能力驗(yàn)證網(wǎng)站提交收到樣品情況。

　　2、仔細(xì)閱讀參指導(dǎo)書，包括標(biāo)本如何保存的信息，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部工作分配，明確工作任務(wù)和要求。

　　3、實(shí)驗(yàn)前應(yīng)嚴(yán)格按照作業(yè)指導(dǎo)書的要求制訂檢驗(yàn)流程，認(rèn)真做好準(zhǔn)備工作，包括實(shí)驗(yàn)中需要使用的器皿，須提前做好清潔滅菌。

　　三、能力驗(yàn)證樣品處理。

　　1、定量項(xiàng)目，西林瓶內(nèi)樣品不可分割，應(yīng)全部用于檢測。一般參考書指導(dǎo)的是加40mL稀釋液制成40mL樣品。

　　2、定量項(xiàng)目樣品稀釋。指導(dǎo)書標(biāo)明了稀釋范圍的，在稀釋范圍左右各加1個(gè)稀釋度進(jìn)行；書上沒有稀釋范圍的，多做稀釋倍數(shù)，選擇合適的稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)（一般可稀釋至10-8）。

　　3、定量項(xiàng)目，除了要多做稀釋倍數(shù)外，同時(shí)同一稀釋度要多倒幾皿，從原理上來講，檢測過程屬于隨機(jī)抽樣檢查，平板越多，數(shù)據(jù)越接近真值。考慮性價(jià)比，又不可能一直瘋狂一個(gè)稀釋度很多平板，所以能力驗(yàn)證時(shí)候多倒幾皿，求好結(jié)果。

　　4、定性項(xiàng)目有一些重要步驟。

　　a、增菌及分離步驟尤其重要。選擇合適的增菌液和分離用培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌的檢出非常關(guān)鍵，選擇兩種以上的增菌液和分離用培養(yǎng)基對(duì)菌株作直接分離和增菌后分離。

　　b、劃線分離十分重要，要把增菌液中的目標(biāo)菌盡量多的表達(dá)出來，要分出單個(gè)菌落并盡可能多挑取可疑菌落，確保分離到目標(biāo)菌。

　　c、生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)以營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)細(xì)菌為好。

　　四、實(shí)驗(yàn)過程一定要做陰陽對(duì)照，全程空白對(duì)照。

　　再厲害的高手也有失手和看走眼的時(shí)候，所以陰陽對(duì)照就是一面鏡子。對(duì)于一些熒光染色后進(jìn)行判讀的實(shí)驗(yàn)顯得尤為重要。

　　這里掃盲一個(gè)誤區(qū)，定量計(jì)數(shù)測菌數(shù)時(shí)，我們會(huì)認(rèn)為空白就是直接取1mL無菌水然后加入到平板里，然后混菌倒皿，這是錯(cuò)誤的。因?yàn)檫@樣做的話，只能模擬證明稀釋后倒平板這一步有沒有污染。而無法證明從樣品稱取-樣品稀釋時(shí)候的污染質(zhì)控情況。所以要做全程空白對(duì)照。

　　全程空白的含義就是把無菌液當(dāng)成樣品，然后走一遍實(shí)驗(yàn)過程。如果嚴(yán)格這么做的話，又會(huì)走向另一個(gè)極端，所以全程空白只從取樣開始至稀釋10-1做了簡化，而不做后續(xù)稀釋空白樣的混菌實(shí)驗(yàn)。

　　在有些其他實(shí)驗(yàn)時(shí)候，會(huì)有樣品空白以及稀釋液空白，比如大氣環(huán)境NOx和SO2的檢測，有興趣的可以去看看，對(duì)于全程空白的意義理解有更好的幫助。

　　五、培養(yǎng)基方面需要注意的地方。

　　1、培養(yǎng)基配制充分混勻后再滅菌。

　　正確做法是用一部分水?dāng)嚢杈鶆蚝?，再加入剩余水量，混勻后滅菌或分裝。

　　2、混菌法倒皿要充分混勻。

　　培養(yǎng)基倒完要左5圈右5圈（混勻速度一定要慢，目的是——避免培養(yǎng)基波動(dòng)到二皿接觸的縫隙部分造成后續(xù)污染），找較水平位置冷卻凝固。

　　3、微生物限度過濾結(jié)束后培養(yǎng)基要不要覆蓋問題。

　　覆蓋的目的是為了阻止活菌在培養(yǎng)基表層通過鞭毛移動(dòng)，造成片狀生長，無法計(jì)數(shù)這一不利現(xiàn)象的發(fā)生。這里可以發(fā)揮主觀能動(dòng)性-對(duì)于不運(yùn)動(dòng)的菌，可以不覆蓋，對(duì)于運(yùn)動(dòng)的菌覆蓋。

　　總結(jié)一下：

　　a長期檢測同一種樣品，不覆蓋并無蔓延現(xiàn)象，不覆蓋；長期檢測蔓延選擇了覆蓋，一直覆蓋。

　　b未知樣品，進(jìn)行覆蓋和不覆蓋的比對(duì)實(shí)驗(yàn)，然后決定以后同樣的樣品是否需要覆蓋。養(yǎng)成經(jīng)驗(yàn)。

　　c能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，覆蓋和不覆蓋的都做，不要吝惜那么一點(diǎn)點(diǎn)培養(yǎng)基或耗材，畢竟能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)做的漂亮才是實(shí)驗(yàn)室（是室而不是人?。┠芰Φ木C合體現(xiàn)。

　　4、培養(yǎng)過程防止平皿干燥。

　　培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基可以倒的適當(dāng)厚一些，比如25mL。培養(yǎng)箱底部接一個(gè)不銹鋼盆，裝上足量無菌水（沒有就去買幾瓶什么的水倒里面）。

　　5、培養(yǎng)完成要保留實(shí)驗(yàn)平皿和其他相關(guān)材料。

　　作為能力驗(yàn)證，原始記錄及實(shí)驗(yàn)報(bào)告還沒出具完成，各種材料還是保留至數(shù)據(jù)出具后較好，便于出現(xiàn)問題現(xiàn)查原因，馬上補(bǔ)救。

　　題外話：很多檢測員等結(jié)果出了問題然后到網(wǎng)絡(luò)上來求救，結(jié)果一問平皿已經(jīng)洗掉了，那就不知道是什么狀況了。有時(shí)候你問她她還會(huì)振振有詞的講：10-1，10-2都蔓延了，不洗掉干嘛，10-5，10-6沒長菌，不洗掉干嘛？我當(dāng)時(shí)真的無語，也不想多說話就沒繼續(xù)講了?，F(xiàn)在我回答一下這個(gè)問題：我要你一套完整梯度濃度的平皿，可以看出你10倍稀釋梯度是不是穩(wěn)定，還有蔓延是個(gè)什么狀況，到底有多少，是一片還是局部還是很小一部分，然后根據(jù)整體數(shù)據(jù)估算結(jié)果（當(dāng)然實(shí)驗(yàn)做成這樣也基本算失敗了，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)沒有做到你可控的范圍），是補(bǔ)救的一種（并不可取，屬于垂死掙扎）。定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，當(dāng)天做完的稀釋樣品也要放冰箱里，雖然實(shí)驗(yàn)要求不能復(fù)檢或重復(fù)檢測，但作為微生物專業(yè)你是知道菌放在2-8℃下并不會(huì)長多少，如果第二天一看數(shù)據(jù)有蔓延或疑問，馬上再做一次，這樣也應(yīng)該在誤差范圍內(nèi)出數(shù)。

　　6、實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)過程勤觀察。

　　微生物培養(yǎng)過程一般需要幾小時(shí)到幾十小時(shí)，要利用這段時(shí)間觀察培養(yǎng)箱及菌生長情況，比如溫度是否穩(wěn)定，培養(yǎng)室內(nèi)濕度如何等等，多思多看，準(zhǔn)備預(yù)案。方有可能得到與盲樣一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　原始記錄應(yīng)有條理、思路清晰,完整準(zhǔn)確地記錄菌株鑒定檢驗(yàn)的全過程,原始記錄要包含時(shí)間、試驗(yàn)現(xiàn)象、試驗(yàn)結(jié)果三個(gè)要素，方便試驗(yàn)出現(xiàn)問題的查找。